Всего в экспериментах было использовано шесть самцов дальневосточного лесного кота (ДВК). Два самца были привезены из Пермского и Новосибирского зоопарков, остальные четыре самца были рождены уже на базе: двое - в 2005, ещё двое – 2006 году.

Зверей содержали поодиночке в вольерах площадью 8 и 16 м². В каждой вольере находился деревянный домик. Животных кормили мясом кур шесть раз в неделю (около 0,5 кг на зверя). Животные имели неограниченный доступ к воде.

Всего нами было проведено три эксперимента: первый – в ноябре 2006 года, второй и третий – в апреле и августе 2007 года соответственно.

В первом и втором эксперименте использовалось четыре самца, в последнем – шесть.

Методика первого эксперимента заключалась в предъявлении самцам ДВК экскрементов самки домашней кошки в состоянии эструса. Идентификацию эструса у домашней кошки производили по изменению поведения (учащённая вокализация и потирание, принятие позы лордоза). Для сбора экскрементов животное помещали в отдельную клетку размером 1×0,5×0,5 м, под клеткой размещался лоток. Собранные экскременты замораживали и хранили при температуре -18ºС. Перед предъявлением от замороженного образца отделялась порция весом примерно 1 г и помещали в новую пластиковую чашку Петри, чтобы избежать попадания в образец посторонних веществ. Образец помещался в вольеру к животному до момента знакомства зверя с ним (первого обнюхивания), затем изымался. В течение трёх суток с момента предъявления каждые 3-4 часа производился сбор экскрементов у самцов ДВК. В качестве контроля производился сбор экскрементов в течение трёх суток перед предъявлением с той же периодичностью. Собранные экскременты замораживали при температуре -18ºС и хранили до проведения экстракции иммунореактивных веществ, связывающихся антителами к тестостерону (далее - иммунореактивных веществ).

Методика эксперимента, проведённого в апреле 2007 года, принципиально не отличалась от предыдущей. Котам также предъявлялись экскременты домашней кошки, сбор экскрементов производился по схеме описанной выше. Разница заключается лишь в том, что через три дня после первого предъявления животным предъявлялись экскременты от самки своего вида, находившейся в состоянии эструса. В течение трёх суток после этого также производился сбор экскрементов. Второе предъявление производилось с целью оценки и сравнения гормональных ответов самцов ДВК на запаховые сигналы самок своего и чужого вида. Трёхдневный интервал между предъявлениями выдерживался для того, чтобы гормональные ответы не накладывались друг на друга. Собранные экскременты замораживались до проведения экстракции.

В последнем эксперименте животным предъявляли экскременты от самки своего вида и домашней кошки в состоянии эструса с интервалом в три дня. Сбора экскрементов не производилось, вместо этого для оценки гормональных ответов через час после каждого предъявления производили отлов животных, и взятие крови без обездвиживания зверей. В качестве контроля использовались образцы крови, взятые во время электроэякуляции в конце предыдущего месяца.

Экстракцию образцов проводили по описанной ранее методике (Jewgenow et al., 2006). На электронных весах "Ohaus" взвешивали 0.1 г экскрементов в пробирке Эппендорфа и добавляли 0.1 г трехвалентного оксида алюминия, затем – 0.9 мл 90% метанола. Пробирки встряхивали на протяжении 30 минут при помощи перемешивающего устройства «Экрос». После этого пробирки центрифугировали в течение 10 минут при скорости 4000 об/минуту. В отдельную пробирку многоразовой пипеткой отбирали 200 мкл супернатанта и добавляли 200 мкл дистиллированной воды. Полученные экстракты хранили при температуре -18°С до проведения измерений.

Для определения концентрации тестостерона в плазме крови, собранную кровь центрифугировали в течение одного часа после сбора (20 мин при 6000 об/мин), плазму крови отбирали в новую побирку и Эппендорфа и замораживали при -18°С до проведения анализа. При этом концентрацию гормона определяли напрямую в плазме крови без проведения дополнительной экстракции.

Определение уровня иммунореактивных веществ в экстракте и тестостерона плазме крови проводили методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов «ИФА-Тестостерон» компании Иммунотех (Москва, Россия).

2.3. Результаты исследований.

Эксперимент 1.

Четырём самцам дальневосточного лесного кота (ДВК) предъявляли экскременты самки домашней кошки в состоянии эструса.

На рисунке 4 представлена динамика изменения концентрации тестостерона в экскрементах животных. Нолём обозначено время предъявления.

Рис.4. Динамика изменения концентрации тестостерона в экскрементах животных.

Средний уровень тестостерона составил 600-1100 нг/г экскрементов. В течение всего периода эксперимента он не менялся достоверно (сравнение проводили, используя t-критерий Стьюдента для связанных выборок). Несмотря на некоторое увеличение уровня тестостерона в экскрементах через 24 ч и особенно через 48 ч после предъявления образцов, эти изменения были недостоверны (t-критерий Стьюдента для связанных выборок: N=4, p=0,715).

Эксперимент 2.

Также как и в первом эксперименте, четырём самцам ДВК предъявляли экскременты домашней кошки в состоянии эструса, а также для сравнения производилось предъявление экскрементов самки дальневосточного кота в том же физиологическом состоянии. Предъявления проводились с интервалом в три дня.

На рисунке 5 (а, б) представлена динамика изменения концентрации тестостерона в экскрементах самцов до и после предъявлений.

Рис.5. Динамика изменения концентрации тестостерона в экскрементах самцов ДВК до и после предъявления а) – экскрементов самки домашней кошки; б) – экскрементов самки ДВК.

Средний уровень тестостерона при предъявлении экскрементов самок домашней кошки и ДВК составил 700-2650 и 1259-2200 нг/г экскрементов соответственно. Достоверного изменения концентрации гормона в обоих случаях не обнаружено. Увеличение концентрации тестостерона через 72 часа после предъявлений также недостоверны (t-критерий Стьюдента для связанных выборок: N=4, p=0,242).

Эксперимент 3.

Шести самцам ДВК с интервалом в три дня предъявлялись экскременты самки домашней кошки и самки своего вида. Через час после каждого предъявления производился забор крови у животных.

На рисунке 6 (а, б) представлены средние значения концентрации тестостерона в контрольных образцах крови, взятых примерно за месяц до предъявлений, а также в образцах, взятых через час после каждого предъявления.

Рис.6. Изменение среднего значения концентрации тестостерона в плазме крови самцов в ответ на предъявление экскрементов самки домашней кошки (а) и экскрементов самки ДВК (б).

По представленным на рисунке гистограммам видно, что гормональный ответ на самку домашней кошки был даже выше чем на свой вид, но без достоверных различий. Высокий уровень погрешности объясняется сильным индивидуальным различиями в базальной концентрации тестостерона в крови животных (Рис.7).

Рис.7. Различия в базальной концентрации тестостерона в крови самцов ДВК, использованных в эксперименте.

По представленной диаграмме видно, что значения базальной концентрации тестостерона в крови двух животных превышали остальные в 45-50 раз, что могло сказываться на результатах эксперимента.

При пересчёте значений концентрации на проценты (т.е. контрольный уровень концентрации гормона был принят за 100%, а уровень концентрации в опыте был пересчитан в процентах от индивидуальной базальной концентрации), выраженный гормональный ответ наблюдался в обоих случаях, но также с высоким уровнем погрешности (Рис.8.а, б).

Рис.8. Изменение среднего значения концентрации тестостерона в плазме крови самцов в ответ на предъявление экскрементов самки домашней кошки (а) и самки ДВК (б), выраженное в процентах от базального уровня .

Увеличение концентрации тестостерона в плазме крови после предъявления экскрементов домашней кошки наблюдалось у трёх из шести самцов, использованных в эксперименте. Однако эти изменения были недостоверны (t-критерий Стьюдента для связанных выборок: N=6, p=0,124).При предъявлении экскрементов от самок ДВК гормональный ответ отмечен у 3 из 4 самцов.

2.4. Обсуждение.

Эксперимент 1.

Исходя из литературных данных, мы ожидали гормонального ответа в экскрементах животных в течение первых 24 часов после предъявления. В течение ожидаемого периода существенного увеличения концентрации тестостерона обнаружено не было, незначительное увеличение концентрации гормона через 48 часов статистически не подтвердилось. Таким образом, анализируя концентрации тестостерона в экскрементах животных, мы не смогли выявить четкого гормонального ответа на запаховые сигналы домашней кошки. Причины этого могли быть связаны с тем, что:

1) самцы ДВК были не способны по запаховым сигналам экскрементов самки родственного вида определить её физиологическое состояние;

2) гормонального ответа могло не быть из-за уменьшения остроты обоняния в осенний период (Корытин, Азбукина, 1986);

3) репродуктивная система самцов находилась в неактивном состоянии (Jewgenow et al., 2006), поскольку гон у ДВК проходит в марте-апреле (Гептнер, Слудский., 1972), и именно в этот период реакция самцов на запаховые сигналы самок в эструсе не была связана с увеличением продукции тестостерона.

Для проверки данных предположений следующий эксперимент было решено провести сразу после периода гона у дальневосточного лесного кота, когда репродуктивная система самцов находилась в активном состоянии.

Эксперимент 2.

При проведении следующего эксперимента в апреле 2007 года самцам, как уже говорилось выше, производили предъявление экскрементов эстральных самок домашней кошки и своего вида. Существенного изменения концентрации тестостерона в течение 24 часов после предъявления экскрементов эстральной самки домашней кошки, также как и в предыдущем эксперименте, выявлено не было. Это можно было бы рассматривать, как подтверждение нашего первого предположения о невозможности самцов ДВК идентифицировать состояние эструса у самки другого вида. Однако, наряду с этим, нами не был выявлен гормональный ответ и на самку своего вида. Его полное отсутствие было весьма маловероятно, поскольку сроки гона ДВК, указанные в литературе, ещё не прошли, и, соответственно, репродуктивная система самцов находилась в активном состоянии. По всей видимости, это произошло потому, что резкое увеличение уровня тестостерона в крови самца после предъявления экскрементов эстральной самки носит кратковременный характер, и обнаружить его не удаётся из-за двух особенностей неинвазивного метода исследований, а именно:

- отсрочки во времени (т.е. выведение метаболитов гормона в экскрементах происходит гораздо позже выброса самого гормона в кровь) (Brown et al., 1994);

- кумулятивности гормонального ответа (т.е. накопления метаболитов тестостерона в экскрементах за период от одной дефекации до другой, из-за чего чётко зарегистрировать кратковременный выброс тестостерона в кровь после предъявления, если таковой был, крайне сложно; он как бы сглаживается и обнаруживается не виде резкого и кратковременного скачка концентрации гормона, а как постепенное её увеличение и снижение).

Таким образом, мы пришли к заключению, что неинвазивный метод исследований не совсем подходит для нашей работы. Методика была скорректирована, и в последнем эксперименте, как описывалось выше, у самцов через час после предъявления производился забор крови.

Эксперимент 3.

В конечном итоге нам удалось выявить гормональный ответ у самцов ДВК на предъявления экскрементов эстральных самок своего и родственного вида. В первом случае положительная реакция была выявлена у 75% животных, во втором – у 50%. Тем не менее, при подсчёте средних значений концентрации тестостерона просматривалась положительная реакция самцов только на самку домашней кошки, что само по себе было необычно, поскольку в процентном соотношении большее число животных положительно среагировало на самку своего вида. Кроме того, средние значения имели высокий уровень среднестатистической погрешности. Объяснить это можно малой выборкой животных и, наряду с этим, сильным индивидуальным различием в базальной концентрации тестостерона в крови самцов (отсутствие реакции на самку своего вида у самца Пермь сильно влияло на среднее значение, поскольку базальная концентрация тестостерона в его крови в 50 раз больше, чем у других самцов). У остальных трех самцов была четко выражена реакция на запаховые сигналы самки своего вида.

Исходя из всего вышесказанного, можно предположить, что неинвазивные методы определения гормонального статуса животных не совсем подходят для оценки реакции самцов на запаховые сигналы эстральных самок. Следует, однако, отметить, что в нашем случае и в качестве источников запаха и для оценки гормонального ответа использовались только экскременты животных. Это также может быть причиной того, что мы не могли зафиксировать значительное увеличение концентрации тестостерона, а если и фиксировали (при заборе крови у самцов), то незначительное, поскольку рядом авторов отмечено, что роль мочи в передаче информации (о виде, поле, возрасте, физиологическом состоянии животного) значительно больше, чем роль экскрементов (Dunbar, 1977; Соколов и др., 1984). У рысей, например, мечение мочой значительно превышает другие виды маркировочной активности во все сезоны года (Найденко и др., 2006). В пользу этого также говорит и то, что эструс является довольно быстрым и кратковременным изменением и ярче отражается в моче (Соколов, и др., 1983), так как метаболиты различных веществ выделяются с ней гораздо быстрее, чем с экскрементами. Возможно также, что из-за более быстрого выведения продуктов обмена веществ с мочой, мы не могли обнаружить резкого кратковременного увеличения концентрации тестостерона в экскрементах.

Вместе с тем, у дальневосточного лесного кота очень хорошо развиты анальные железы, играющие важную роль в химической коммуникации кошачьих. У ДВК экскременты имеют необычайно сильный запах по сравнению с другими видами кошачьих. Опираясь на это, мы предположили, что, с одной стороны, в экскрементах этих животных, скорее всего, передаётся более подробная информация об индивидууме, а с другой (и это вытекает из первого предположения) – ДВК, возможно, способны получать по запаховым сигналам экскрементов более полную информацию о собратьях, нежели представители других видов кошачьих. Но, в результате проведения наших экспериментов подтвердить или опровергнуть эти предположения не удалось.

Тем не менее, нам удалось обнаружить определенный гормональный ответ у части самцов ДВК на запаховые сигналы самки домашней кошки в состоянии эструса, который был незначительно меньше гормонального ответа на химические сигналы эстральной самки своего вида. Хотя эти данные не подтверждёны статистически, мы всё же можем предположить, что при наличии малого количества рецептивных самок своего вида или их отсутствии на территории самца ДВК, он, вероятно, будет в состоянии обнаружить эстральную самку домашней кошки и, возможно, спарится с ней. Также это может произойти в том случае, если все самки, на территории самца окажутся оплодотворены, так как репродуктивная система самцов ДВК остаётся в активном состоянии ещё, по крайней мере, два месяца после окончания гона. К сожалению, говорить о том насколько расширяются участки обитания самцов ДВК в период гона и перекрывают ли они участки обитания самок домашних кошек, как в случае с европейским лесным котом (Szemethy, 1993), а также насколько эти животные избегают населённых пунктов (вокруг которых, как правило, и сосредоточены популяции одичавших домашних кошек), мы не можем, поскольку столь детальных исследований пространственной организации ДВК никогда не проводилось.

Таким образом, можно предположить, что физиологические предпосылки к гибридизации этих двух видов в природе всё же есть. Безусловно, прежде чем уверенно говорить о свободной гибридизации ДВК и домашней кошки в естественных условиях, помимо статистического подтверждения этого предположения, необходимо также подробное исследование ряда других вопросов, таких, например, как социальное взаимодействие между особями этих видов, пространственная организация дальневосточного лесного кота, а также пространственная организация одичавших домашних кошек в пределах ареала обитания ДВК.

Выводы

Результаты нашей работы позволяют сделать следующие выводы:

1) метод определения гормонального статуса животных по экскрементам мало применим для оценки реакции самцов на запаховые сигналы эстральных самок;

2) в результате сравнения гормонального ответа самцов дальневосточного лесного кота на запаховые сигналы эстральных самок своего вида и домашней кошки была выявлена несколько более интенсивная реакция на самку своего вида;

3) часть самцов ДВК показывала гормональный ответ на экскременты эстральных самок домашней кошки, что говорит о возможности идентификации потенциальных половых партнеров и среди близкородственных видов;

4) выявлена значительная индивидуальная разнокачественность в гормональном статусе самцов дальневосточного лесного кота.